이온 채널
Ion Channel
1. 개요
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이온채널 (이온통로)는 신경세포를 포함하는 모든 종류의 세포에 존재하는 세포막 관통단백질이다. 이온수송체와 더불어, 세포의 이온 항상성 조절에 기여하며, 개폐조절 및 기전을 통해 세포막의 흥분성 조절에 기여한다. 이온통로는 통과하는 이온의 종류에 따라, 일, 이가 양이온(Ca2+, Na+, K+)과 음이온(Cl-)등으로 구분된다. 이온통로의 pore가 개방되면 세포 내외질에 존재하는 이온이 이온통로 단백질 내부에 형성되는 통로를 따라 이동한다. 이러한 이온의 이동에 의해 세포막을 기준으로 세포 안과 밖에 전압차가 형성되고, 세포막 전압전압이 시간적으로 변화됨으로서 흥분성의 변화가 나타난다.
이온통로들의 역할과 작용은 흥분성세포들(신경세포, 골격/심장/평활근 세포, 이자 B-세포)에서 광범위하고 깊은 연구가 진행되어 왔다. 세포 흥분성은 세포의 종류에 따른 세포고유의 기능 조절에 관여를 한다. 흥분성의 의미는 세포가 전기적으로 안정한 상태에서 측정되는 안정기 세포막 전압(-60 ~ -70 mV)이 보다 높은 전압 방향 (positive potential, 약 +20~ 30 mV)으로 전환되는 것을 의미한다. 전압변동의 범위는 역치전압을 넘어서는 전압변화는 활동전압으로 정의한다. 활동전압의 전압 변동은 안정막전압에서 최대 +20~30 mV까지 증가 하였다가 안정막 전압을 지나 저분극 상태까지 감소후 다시 안정막 전압으로 돌아온다.
세포막이 활동막 전압과 안정막 전압을 보이는 이유는 전압 변동범위에서 작용하는 이온통로의 종류와 연관이 되어 있으며, 이온통로의 단백질 구조와 관련이 되어 있다.
전형적인 이온 통로는 세포막을 관통하는 6개의 helix (기둥)이 연결된 구조를 지니고 있다. 그로 인해 6 transmembrane proteins이라고도 불린다. 각각의 Helix는 S1, S2...S6라고 붙리며, 이중 S1부터 S4까지는 voltage sensing domain으로 세포막전압의 변화를 감지하는역할을 한다. 보통 이러한 domian들의 형성은 전압의존성 포타슘 이론통로(Voltage-gated potassium channel: K channel)에서 주로 나타난다. n-terminal과 C-terminal domain이 세포질 쪽에 위치하고 4개의 subdomain이 조립되어 기능적 이온통로를 형성한다. 하지만 이온통로의 종류에 따라 막관통 부위를 2개만 가진 경우도 있으며, 전압의존성 나트륨 이온통로와 전압의존성 칼슘 채널의 경우 4개의 subdomain들이 링커를 통해 연결되어있어 전사와 번역을 통해 하나의 단백질이 합성된후 조립과정을 거친후 기능을 가진 이온통로를 형성한다.
이온통로의 전압감지 domain의 구조변화를 통해 이온통로의 Pore가 열리게 된다. 그리고 나머지 S5과 S6는 포어 형성 부위 (Pore forming region)로서 실제적으로 이온이 통과하는 부분으로 selectivity filter와 같은 이온통로의 기능과 연관되어 있는 중요부위이다.
Pore 개폐기전에 따라 이온통로는 전압의존성(Voltage dependent), 리간드 게이팅(ligand gated), receptor operated, store operated, mechano sensitive 등으로 다양하게 분류된다.
2. 종류
- Voltage gated-Ca channels (전압의존성 칼슘 통로): 세포외부의 칼슘을 선별적으로 세포안쪽으로 통과 (이동) 시키며 전압의존성 나트륨 통로 대비 1000배의 선택성을 가지도 있음. Calcium:Na-1000:1))
- Voltage gated-Na channels: 세포막 전압과 활동전압의 형성의 주체인 이온통로로 나트륨 (소듐)이온에 대한 높은 선택성을 가짐.
- K channels
- Voltage gated-K channel
- Calcium activated-K channel
- Inward rectifier K channel
- Two pore K channel
- Transient Receptor Potential channels
- TRPC channels
- TRPA channels
- TRPV channels
- TRPP channels
- TRPM channels
- TRPML channels
- Cl channel
- Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated ( HCN) channel
- Ba channel
3. 연구방법
이온 채널들을 연구할 때는 보통 patch clamp라는 실험기법을 사용한다. 전기생리학(Electrophysiology)에서 ion channel에 대하여 연구하기 위해 주로 사용되는 기법이다.
사실 이온 통로 자체를 연구하기 위한 기법으로 사용하지만, 다양한 세포의 전기적 활동을 연구하는데에도 적용될 수 있다. 주로 신경세포, 근육, pancreatic Beta cell (B-이자세포)에서 나타나는 전기적 흥분성의 변화를 기록하고 분석하는데 사용한다.
patch clamp는 다음과 같은 과정으로 진행된다. 가는 유리관(모세관)의 중간에 열을 가하여 양쪽으로 잡아당기면 열이 가해지는 가운데가 점점 가늘어지며 길이가 늘어난다. 그뒤 잠시 가열을 중단하고 열을 식힌다.
가운데만 가늘게 길어진 유리관의 중간에 다시 열을 가하면서 빠르게 양쪽으로 잡아당기면 좀더 가늘어지며 살짝 길어지다가 서로 떨어지게된다. 결국엔 두개의 미세유리관이 만들어진다. 아주 작은 스포이드정도로 상상할 수 있다.
이 미세유리관의 가장 뾰족한 부분의 지름은 1마이크로미터 가량이다. 맨눈으로는 세포와 유리관을 동시에 볼 수 없고 오직 현미경을 통해 세포와 유리관을 동시에 볼수 있다.
다만 세포와 미세유리과의 높이 차이가 발생을 하기 때문에 세포와 미세유리관이 같은 위치에 오게끔 초점을 조절하는 과정을 거친다. 미세유리관과 세포를 동시에 볼수 있는 상태로 만들려면 먼저 세포보다 높은 위치에서 미세관을 찾아서 천천히 아래쪽으로 이동시킨다. 이때 모세유리관을 내리면서 초점을 거의 동시에 맞춰야하는데 쉽지않기 때문에 미세관 하강 후 초점조절 다이얼을 돌려 미세관에 초점을 맞추는 과정을 반복한다. 어느정도 익숙해지면 양손을 이용하여 동시에 할 수 있다.
미세유리관이 세포와 거의 비슷한 높이에 도달을 하면 미세관과 흐리한 상태의 세포를 동시에 볼 수 있게 된다. 약간의 높이 조절을 하면 세포와 미세관에 초점이 맞춰진다. 다만 여전히 미세관의 높이는 세포보다 높이 있어야 한다.
그다음은 미세유리관을 천천히 세포막에 위에 가도록 조작하여 세포막에 안전히 안착을 시킨다. 이때 전류 기록용 소프트웨어를 보면 세포막에 유리관이 무사히 인착되면 저항이 약간 상승하고 테스트 전류에 의해 전류가 감소하눈 것을 볼 수 있다.
이때 음압을 가하면 세포막과 미세관이 강하게 밀착되고 세포막과 유리관 사이에 틈세가 없어진 상태로 저항이 무한데에 이르게 된다. 이상태에서는 전류는 오직 미세유리관과 세포막 사이에서만 흐를 수 있는 상태가 된다.
Patch clamp에서 patch 즉 세포막의 작은 조작 혹은 아주 작은 일부만을 고착시킨 상태를 의미하며 손가락 끝으로 피부를 꼬집어 잡고 있는 상태를 상상할 수 있다.
기가 옴 밀착을 만든후 음압을 좀더 가하면 세포막에 구멍이 형성되고 이 구멍을 통해 세포질을 원하는 조성으로 대치하고 미세유리관에 존재하는 염화은선을 통해 세포막 전압과 전류를 측정할 수 있다. 이럴 경우 세포막 전체에 존재하는 이온통로의 개폐에 따른 잔류를 측정할 수 있고 이상태는 Whole cell configuration이라고 부른다.
혹은 기가 옴 밀착을 만든후 미세조작기를 이용하여 세포막의 일부를 뜯어 낼 경우 미세유리관 안쪽의 이온 채널만의 전류 현상을 선택적으로 측정 할 수 있고 세포질 안쪽이 세포밖용약에 노출 되기때문에 inside-out락 부르고 진정한 patch라고 할 수 있다.
또다른 경유 wholecell patch를 만든후 세포막을 뜯어 내면 세포외부막이 저절로 붙으면서 작은 소낭을 만드는데 이때도 세포막의 극히 일부에 존재하는 이온 채널을 얻을 수 있고 세포막와부가 세포박용액에 노출 되기 때문에 outside-out patch라고 한다.
Inside out과 outside out은 거의 단하나의 이온통로를 얻을 수 있기 때문에 single channel recording(단일이온통로기록)이라고 부른다.
패치 클램핑과는 별개로 미세유리관이 세포막을 뚫어버린후 세포 안쪽에 위치할경우, 세포 내부의 전류를 측정하게 되는데 이러한 실험은 intracellular recording이라고 정의한다. 세포와 유리관 내의 용액은 전해질이기 때문에 이온 채널이 작동하면 전류의 변화가 용질에 전달되고, 그러면 유리관 내부의 염화은이 그 전류를 증폭하여 계측기에 전달해서, 결론적으로 이온 채널에 유발된 이온 농도의 변화 즉 전류의 변화를 기록하게 된다.
실제로는 전해질의 이온 비율과 유리관을 미세하게 조정하는 정밀기술, 나노 단위의 전류 통제와 측정 등 미칠듯한 기술력이 조합되어 만들어진 기술. 참고로 엘빈 네어과 베르트 자크만은 이 기법으로 1991년 노벨상을 수상했다.
[1] 1. channel domain (typically four per channel), 2. outer vestibule, 3. selectivity filter, 4. diameter of selectivity filter, 5. phosphorylation site, 6. cell membrane[2] 이상 high threshold voltage[3] 밝혀진 것 중에 유일한 low threshold voltage type인 Ca channel이다.