컬럼 크로마토그래피
'''Column chromatography'''
혼합물을 분리하는 방법 중, 긴 원통형의 고정상을 이용하는 방법. 고정상으론 보통 실리카를 사용하고, 용매는 상황에 맞춰서 변화시킨다. 분리하고자 하는 혼합물의 질량에 따라 컬럼의 두께가 달라진다.
우선 혼합물을 TLC로 전개하여 어떤 용매에서, 분리하고자 하는 물질의 전개율을 확인해야한다. 보통 전개율[1]이 0.3 ~ 0.4 정도가 되어야 분리가 쉽게 되는 편이다. 이동상으로 쓰일 용매는 무수히 많지만, 많은 경우에서 헥세인과 에틸 아세테이트를 혼합한 용매를 이동상으로 사용한다. 극성이 매우 커서 에틸 아세테이트 만으로도 전개가 되지 않을 경우엔, 메틸렌 클로라이드에 소량의 메탄올을 섞어서 사용한다. 메탄올은 실리카를 녹여낼 수 있는 용매이므로 메탄올만 사용해서 크로마토그래피를 진행하는 것은 권장되지 않는다. 그래도 전개가 되지 않을 경우엔 역상 크로마토그래피를 진행하는 것이 속편할 것이다(...).
전개용매를 정했으면 실리카 컬럼을 만들어야한다. 분리하려는 혼합물의 양이 많으면 많을수록 컬럼의 두께가 두꺼워야한다. 그렇다고 너무 두꺼운 컬럼을 사용하면 낮은 농도로 나오기 때문에 TLC로 확인이 어려울 수 있다. 즉, 적당한 두께의 컬럼을 골라야한다.
컬럼의 콕은 구멍이 크게 뚫려있는 것이기 때문에 여기에 그대로 실리카를 부어버리면 그대로 아래로 쏟아진다. 그렇기 때문에 컬럼의 맨 아래부분을 솜으로 틀어막아야한다. 그렇다고 솜을 너무 많이 넣으면 이동상인 용매가 거의 나오지 않는 대참사가 벌어지니 약간만 넣도록 해야한다. 이후엔 packing의 과정이 필요하며, 앞서 정한 용매를 이용해서 packing을 해야한다. Wet packing과 dry packing으로 두 가지로 나뉘는데, dry packing이 훨씬 쉬운 편이다.[2]
Wet packing은 실리카를 용매와 섞은 뒤 컬럼에 부어서 패킹을 하는 방식이다. 가장 기본적이고, 패킹도 잘 되는 편이다. 그러나 원래 실리카는 극성이 큰 용매가 아니면 녹지 않는 가루로 떠다니는데다, 거의 겔처럼 되어있다. 그 혼합물을 재주껏(...) 컬럼에다 부어넣어야하는데 컬럼이고 바닥이고 비커고 실리카가 떨어지지않고 붙어있게 되어서 굉장히 지저분해진다. 그래도 packing이 공기방울의 방해를 받거나 하는 일이 적은 편이기에 쉽게된다.
Wet과는 반대로 실리카를 마른 상태 그대로 컬럼에 넣어버리기 때문에 dry packing이라고 부른다. 그 후 용매를 실리카 위에다 그대로 부어버리고, 압축공기로 밀어내는 방식으로 packing을 한다. Wet 방식처럼 컬럼에 실리카를 채우는 과정이 수고스럽지도 않고, 실리카를 담아둔 비커에 말라붙은 실리카도 없기에 깨끗하고 쉽게 할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 문제는 packing 도중에 공기방울의 방해를 받을 가능성이 매우, 반드시에 가까울 정도다. 그래서 wet에 비해 packing 시간이 오래 걸리나 간편하기 때문에 선호되기도 한다.
Packing이 끝난 실리카 컬럼에 혼합물을 흡착시키는 과정을 loading이라고 한다. Loading을 할 때 주의해야하는데, loading 해준 두께가 너무 두꺼우면 섞이는 구간이 많이 생기게 되며, 편평하지 않고 휘어있으면 휜 모양 그대로 샘플이 내려오는 대참사가 벌어진다.
혼합물을 최소한의 용매로 녹여서 액상으로 만들어서 loading을 하는 것이 최선의 방법이다. 전개용매가 혼합물을 매우 잘 녹여 10 방울 내외의 용매로 전부 녹일 수 있다면 최고의 조건이라고 할 수 있다. 그렇게 녹여낸 용액을 벽을 따라, 실리카 컬럼의 맨 위에 조금씩 떨어지게 해주면된다. 벽면에 묻은 용액도 아주 약간의 용매로 녹여서 loading을 해주고 콕을 연 상태에서 실리카 컬럼과 액체 부분의 높이가 거의 같은 수준이 되게 해준다. 이 때 압축공기 등으로 빠르게 loading을 할 수 있다. 그 후엔 모래[3]를 실리카 컬럼 위에 얹어서 완충재로 사용한다. 후에 용매를 부었을 때 용매로 인해 실리카 컬럼이 손상되는 것을 막기 위함이다.
만약 혼합물이 전개용매로 녹지 않는다면, 극성이 높은 용매를 약간만 사용해도 괜찮다. 메틸렌 클로라이드와 같은 용매는 극성을 크게 증가시키지 않으면서 많은 용매를 녹여낼 수 있기 때문에 소량씩 사용되기도 한다. 그러나 그런 경우에도 녹지 않는 상황이 있는데, 그럴땐 dry loading을 해야 속이 편할 것이다(...).
처음부터 샘플을 실리카에 흡착시켜서 loading하는 방법인데, 여러가지로 귀찮은 상황이 발생할 수 있기에 가능하면 혼합물을 녹일 수 있는 용액을 찾는게 좋다. 있더라도 용액의 극성이 지나치게 크다면 dry loading을 하는 것이 낫다.
혼합물을 조금이라도 많이 녹이되, 감압증류로 쉽게 제거할 수 있는 용매로 혼합물을 녹인다. 그 후 그 용액에 실리카를 적당량 넣고 섞어주고, 감압증류로 용매를 제거해준다. 성공적으로 했다면 실리카가 모래처럼 바짝 말라 흘러다닐것이다. 만약 그렇지 않고 끈적이거나, 마른 상태가 아닌 상태라면 실리카가 모자라므로 조금 더 넣어서 다시 감압증류를 하면 된다.[4][5] 이후 샘플이 흡착된 실리카를 컬럼 위에 그대로 부어버리고 전개용매를 약간 넣어 그 부분도 packing이 될 수 있게 한다. 그 뒤는 똑같이 seasand를 넣고 전개용매를 넣어 크로마토그래피를 진행하면 된다.
거의 대부분의 혼합물을 분리할 수 있기 때문에 유기화학 실험이나 생화학 실험에서 애용되는 기술이다. 유기화학 실험실의 경우 많은 시간을 컬럼 크로마토그래피로 혼합물을 분리하는데 보내게된다.
그러나 굉장히 피곤한 것이, 언제 어느 구간에서 원하는 화합물이 나오리라는 보장이 없다. 그렇기 때문에 자리를 비우지 못하고 계속해서 TLC로 물질의 여부를 확인해줘야하며, 식사시간이 겹친다고 해서 콕을 잠가둘 수도 없다. 콕을 잠그면 컬럼 내부에서 혼합물들이 확산되어 band broadening이 일어나며, 농도도 옅어지고 목표 화합물이 다른 화합물과 영역이 겹쳐 분리가 되지 않는 일이 벌어진다.
본디 컬럼 크로마토그래피는 중력으로 이동상을 흘려보내는 것이나, 이러기엔 너무 시간이 오래걸리기 때문에 압축공기로 용매를 밀어내어 빠르게 분리가 일어나게 할 수 있다. 이 방법을 flash column chromatography라고 부르며, 중력만을 사용할 때보다 훨씬 적은 시간내에 분리가 가능하다. 다만 압력으로 인해 컬럼의 가운데에만 집중적으로 용액이 내려가 band가 u자 형으로 변할 수 있어 분리가 더 힘들어질 가능성도 있다.
이렇게 시간이 오래걸리고 고된 방법인지라 자동으로 분리해주는 기계가 나와있긴하다. UV 검출기로 용질이 나오고 있다는 것을 알려주기도 하고, 자동으로 용출액을 받을 바이알도 교체해주기 때문에 편하지만, 전개용매에 대한 기질의 용해도가 떨어지면 컬럼 중간에 석출되는 사고가 벌어지면 분리가 힘들어지기 때문에 여전히 수동으로 하는 것을 더 선호한다.
1. 개요
혼합물을 분리하는 방법 중, 긴 원통형의 고정상을 이용하는 방법. 고정상으론 보통 실리카를 사용하고, 용매는 상황에 맞춰서 변화시킨다. 분리하고자 하는 혼합물의 질량에 따라 컬럼의 두께가 달라진다.
2. 방법
우선 혼합물을 TLC로 전개하여 어떤 용매에서, 분리하고자 하는 물질의 전개율을 확인해야한다. 보통 전개율[1]이 0.3 ~ 0.4 정도가 되어야 분리가 쉽게 되는 편이다. 이동상으로 쓰일 용매는 무수히 많지만, 많은 경우에서 헥세인과 에틸 아세테이트를 혼합한 용매를 이동상으로 사용한다. 극성이 매우 커서 에틸 아세테이트 만으로도 전개가 되지 않을 경우엔, 메틸렌 클로라이드에 소량의 메탄올을 섞어서 사용한다. 메탄올은 실리카를 녹여낼 수 있는 용매이므로 메탄올만 사용해서 크로마토그래피를 진행하는 것은 권장되지 않는다. 그래도 전개가 되지 않을 경우엔 역상 크로마토그래피를 진행하는 것이 속편할 것이다(...).
전개용매를 정했으면 실리카 컬럼을 만들어야한다. 분리하려는 혼합물의 양이 많으면 많을수록 컬럼의 두께가 두꺼워야한다. 그렇다고 너무 두꺼운 컬럼을 사용하면 낮은 농도로 나오기 때문에 TLC로 확인이 어려울 수 있다. 즉, 적당한 두께의 컬럼을 골라야한다.
컬럼의 콕은 구멍이 크게 뚫려있는 것이기 때문에 여기에 그대로 실리카를 부어버리면 그대로 아래로 쏟아진다. 그렇기 때문에 컬럼의 맨 아래부분을 솜으로 틀어막아야한다. 그렇다고 솜을 너무 많이 넣으면 이동상인 용매가 거의 나오지 않는 대참사가 벌어지니 약간만 넣도록 해야한다. 이후엔 packing의 과정이 필요하며, 앞서 정한 용매를 이용해서 packing을 해야한다. Wet packing과 dry packing으로 두 가지로 나뉘는데, dry packing이 훨씬 쉬운 편이다.[2]
2.1. Wet packing의 경우
Wet packing은 실리카를 용매와 섞은 뒤 컬럼에 부어서 패킹을 하는 방식이다. 가장 기본적이고, 패킹도 잘 되는 편이다. 그러나 원래 실리카는 극성이 큰 용매가 아니면 녹지 않는 가루로 떠다니는데다, 거의 겔처럼 되어있다. 그 혼합물을 재주껏(...) 컬럼에다 부어넣어야하는데 컬럼이고 바닥이고 비커고 실리카가 떨어지지않고 붙어있게 되어서 굉장히 지저분해진다. 그래도 packing이 공기방울의 방해를 받거나 하는 일이 적은 편이기에 쉽게된다.
2.2. Dry packing의 경우
Wet과는 반대로 실리카를 마른 상태 그대로 컬럼에 넣어버리기 때문에 dry packing이라고 부른다. 그 후 용매를 실리카 위에다 그대로 부어버리고, 압축공기로 밀어내는 방식으로 packing을 한다. Wet 방식처럼 컬럼에 실리카를 채우는 과정이 수고스럽지도 않고, 실리카를 담아둔 비커에 말라붙은 실리카도 없기에 깨끗하고 쉽게 할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 문제는 packing 도중에 공기방울의 방해를 받을 가능성이 매우, 반드시에 가까울 정도다. 그래서 wet에 비해 packing 시간이 오래 걸리나 간편하기 때문에 선호되기도 한다.
2.3. Loading
Packing이 끝난 실리카 컬럼에 혼합물을 흡착시키는 과정을 loading이라고 한다. Loading을 할 때 주의해야하는데, loading 해준 두께가 너무 두꺼우면 섞이는 구간이 많이 생기게 되며, 편평하지 않고 휘어있으면 휜 모양 그대로 샘플이 내려오는 대참사가 벌어진다.
혼합물을 최소한의 용매로 녹여서 액상으로 만들어서 loading을 하는 것이 최선의 방법이다. 전개용매가 혼합물을 매우 잘 녹여 10 방울 내외의 용매로 전부 녹일 수 있다면 최고의 조건이라고 할 수 있다. 그렇게 녹여낸 용액을 벽을 따라, 실리카 컬럼의 맨 위에 조금씩 떨어지게 해주면된다. 벽면에 묻은 용액도 아주 약간의 용매로 녹여서 loading을 해주고 콕을 연 상태에서 실리카 컬럼과 액체 부분의 높이가 거의 같은 수준이 되게 해준다. 이 때 압축공기 등으로 빠르게 loading을 할 수 있다. 그 후엔 모래[3]를 실리카 컬럼 위에 얹어서 완충재로 사용한다. 후에 용매를 부었을 때 용매로 인해 실리카 컬럼이 손상되는 것을 막기 위함이다.
만약 혼합물이 전개용매로 녹지 않는다면, 극성이 높은 용매를 약간만 사용해도 괜찮다. 메틸렌 클로라이드와 같은 용매는 극성을 크게 증가시키지 않으면서 많은 용매를 녹여낼 수 있기 때문에 소량씩 사용되기도 한다. 그러나 그런 경우에도 녹지 않는 상황이 있는데, 그럴땐 dry loading을 해야 속이 편할 것이다(...).
처음부터 샘플을 실리카에 흡착시켜서 loading하는 방법인데, 여러가지로 귀찮은 상황이 발생할 수 있기에 가능하면 혼합물을 녹일 수 있는 용액을 찾는게 좋다. 있더라도 용액의 극성이 지나치게 크다면 dry loading을 하는 것이 낫다.
혼합물을 조금이라도 많이 녹이되, 감압증류로 쉽게 제거할 수 있는 용매로 혼합물을 녹인다. 그 후 그 용액에 실리카를 적당량 넣고 섞어주고, 감압증류로 용매를 제거해준다. 성공적으로 했다면 실리카가 모래처럼 바짝 말라 흘러다닐것이다. 만약 그렇지 않고 끈적이거나, 마른 상태가 아닌 상태라면 실리카가 모자라므로 조금 더 넣어서 다시 감압증류를 하면 된다.[4][5] 이후 샘플이 흡착된 실리카를 컬럼 위에 그대로 부어버리고 전개용매를 약간 넣어 그 부분도 packing이 될 수 있게 한다. 그 뒤는 똑같이 seasand를 넣고 전개용매를 넣어 크로마토그래피를 진행하면 된다.
3. 특징
거의 대부분의 혼합물을 분리할 수 있기 때문에 유기화학 실험이나 생화학 실험에서 애용되는 기술이다. 유기화학 실험실의 경우 많은 시간을 컬럼 크로마토그래피로 혼합물을 분리하는데 보내게된다.
그러나 굉장히 피곤한 것이, 언제 어느 구간에서 원하는 화합물이 나오리라는 보장이 없다. 그렇기 때문에 자리를 비우지 못하고 계속해서 TLC로 물질의 여부를 확인해줘야하며, 식사시간이 겹친다고 해서 콕을 잠가둘 수도 없다. 콕을 잠그면 컬럼 내부에서 혼합물들이 확산되어 band broadening이 일어나며, 농도도 옅어지고 목표 화합물이 다른 화합물과 영역이 겹쳐 분리가 되지 않는 일이 벌어진다.
본디 컬럼 크로마토그래피는 중력으로 이동상을 흘려보내는 것이나, 이러기엔 너무 시간이 오래걸리기 때문에 압축공기로 용매를 밀어내어 빠르게 분리가 일어나게 할 수 있다. 이 방법을 flash column chromatography라고 부르며, 중력만을 사용할 때보다 훨씬 적은 시간내에 분리가 가능하다. 다만 압력으로 인해 컬럼의 가운데에만 집중적으로 용액이 내려가 band가 u자 형으로 변할 수 있어 분리가 더 힘들어질 가능성도 있다.
이렇게 시간이 오래걸리고 고된 방법인지라 자동으로 분리해주는 기계가 나와있긴하다. UV 검출기로 용질이 나오고 있다는 것을 알려주기도 하고, 자동으로 용출액을 받을 바이알도 교체해주기 때문에 편하지만, 전개용매에 대한 기질의 용해도가 떨어지면 컬럼 중간에 석출되는 사고가 벌어지면 분리가 힘들어지기 때문에 여전히 수동으로 하는 것을 더 선호한다.
[1] 이동상인 용매가 이동한 거리에 대한, 물질의 이동거리 비율이다. 크면 클수록 용매와 상호작용을 강하게 한다는 의미다.[2] 실리카는 폐암을 일으킬 수 있고, 폐 건강에 매우 좋지않다. 다룰 때는 가동 중인 후드에서, 마스크를 쓰고 다뤄야 안전하다.[3] 그냥 모래가 아닌, 굵기들이 거의 일정한 알갱이를 모아둔 것을 따로 판매한다.[4] 만약 감압증류 도중에 용액이 끓어 넘친다면 트랩이고 로터리고 실리카로 전부 오염되어 분해 청소를 해야하는 지옥도가 벌어지므로 범핑을 하지 않도록 신경써줘야한다.[5] 감압증류가 끝나도 플라스크 벽면에 실리카가 붙어서 안떨어지는데, 전부 스패츌라로 긁어서 떨어뜨리도록 해야한다.