현미경
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1. 개요
microscope ・ 顯微鏡
안경, 망원경 등과 같이 특정 물체를 확대해서 볼 수 있는 기계. 육안으로 확인하기 힘들 정도로 미세한 물체(근육조직이나 세포 등)을 보는 데 쓰는 물건이다.
학교 및 연구소, 병원 등지에서 교육 ・ 연구 ・ 치료 목적으로 사용하고 있다.
2. 기원
여러 문헌에서 자하리아스 얀센(Zacharias Janssen, 1580~1638), 갈릴레오 갈릴레이(Galileo Galilei, 1564~1642), 안톤 판 레이우엔훅(Antonie van Leeuwenhoek, 1631~1723) 등을 현미경의 최초 발명자로 거론한다. 1665년에 로버트 후크 (Robert Hooke) 가 현미경에 근접한 장치를 만들어 처음으로 코르크를 확대 해 보았을때 그는 벌집같은 형태를 띈 구조를 관찰하였고 이러한 모양을 수도원의 작은 각방(cell)에 비교했다. 얀센은 렌즈를 처음으로 개발한 사람으로 알려져 있고, 레이우엔훅은 현대의 현미경과 가장 유사한 현미경을 만들어서 미생물을 세상에 최초로 알린 사람이다. 로버트 후크가 코르크를 관찰했을때는 코르크는 살아있는 조직이 아니기 때문에 세포의 핵이나 subcellular structue를 볼 수 없었기에 레이우엔훅이 처음으로 생명체의 세포단위를 본 사람이라고 할 수 있겠다. 얀센이 렌즈를 개발한 지 수십 년이 지난 후 네덜란드의 레이우엔훅은 렌즈를 연마하는 방법과 금속을 세공하는 방법을 익혀, 눈으로 볼 수 없는 작은 물질을 볼 수 있는 현미경을 만들었다. 그가 만든 현미경은 40~270배까지 확대해 볼 수 있었다. 그는 제작한 현미경이 400개가 넘을 정도로 현미경 만드는 일에 빠져들었다. 단순히 무엇을 발명한 사실보다는 그 발명의 영향력을 중시하는 서양인들의 사고방식 때문인지 '현미경의 최초발명자'를 레이우엔훅으로 본다. 이러한 별명을 얻게 된 것은 그가 제작한 현미경이 대물렌즈와 대안렌즈를 이용한 것으로 오늘날의 현미경과 비슷한 모양을 하고 있기 때문이기도 하고, 최초기 때문이기도 하다.
레이우엔훅은 본래 비단 등의 각종 직물을 파는 상인이였는데, 고객들에게 자신이 파는 직물이 품질이 좋은 것임을 증명하기 위해 현미경을 만들었다가 현미경으로 직물 외의 것들을 관찰하기 시작했다. 그는 자신이 만든 현미경으로 냇물이나 빗물과 같은 용액 속에 어떤 물질이 들어 있는지를 관찰하기도 하고, 정자 [1], 곤충, 동물에서 얻은 각종 작은 물질도 관찰했다. 현미경을 만든 직후에는 시험 삼아 여러 종류의 물을 한 방울씩 떨어뜨려 놓고 관찰을 했다. 레이우엔훅은 이런 과정을 통해 세포의 존재를 처음 확인했으며, 최초로 원생동물을 비롯한 미생물의 존재를 알아냈다. 레이엔후크는 자신의 연구결과를 널리 알리지 않았지만, 그의 연구결과를 네덜란드의 의사 레이니어르 더 흐라프(Reinier de Graaf, 1641~1673)가 알게 된 이후 레이엔후크의 연구가 세상에 알려졌다.
3. 구조
4. 용어
4.1. 해상도
일반적으로 광학 현미경의 성능을 이야기 할때 배율로 이야기 하는 경우가 많으나, 이는 일반적인 광학 현미경의 경우이고, 최근들어 개발되는 레이저를 이용한 scanning 타입의 현미경에서는 scanning 범위에 따라 배율이 변화 하기 때문에 주로 해상도를 성능의 지표로 한다. 해상도는 두점이 떨어져 있는 거리를 구별 가능한 능력이라 보면된다. 시력을 이야기 할때 사용하는 도수를 생각해 보자. 종이에 두 점을 찍어 놓고 멀리 가져가면, 어느 순간 부터는 두 점을 구별하지 못하고 한개의 점으로 보이게 된다. 시력이 좋다는 이야기는 더 멀리서도 이것이 한개의 점인지 두개의 점인지 구별 가능하다는 의미이다. 이와 마찬가지로 현미경에서도 두 점의 간격이 더 좁더라도 구별 가능한 것을 '해상도가 좋다' 라고 표현한다. 일반적으로 해상도는 대물렌즈의 성능(NA: Numerical aperture)에 의해 결정된다. 영상에서 얼마만큼의 넓이를 확대 했는가? 라는 지표는 FOV(Field of view)라는 용어로 나타낸다. 영상에서 가로 세로 크기가 얼마나 되는지에 대한 지표이다. 최근에는 주로 디지털화 된 영상을 획득하게 되므로 영상에서의 가로 세로 pixel 사이즈와 FOV, 그리고 해상도의 관계가 매우 중요해 진다.
예를 들어 해상도가 1μm인 현미경에서 영상을 촬영하였고, 이 영상이 샘플에서 가로세로 300μm의 영역을 촬영한 영상이라고 하자. 이때, pixel 사이즈를 300pixel 이상으로 할 경우 어차피 pixel to pixel 의 거리값이 해상도 보다 작아져 버리기 때문에 영상의 질이 더 좋아지지는 않는다.(oversampling) 해상도 떨어지는 사진을 크기만 늘린다고 추가적인 정보를 제공하지 않는 것과 비슷하다. 하지만, 300pixel보다 작은 값으로 촬영할 경우 pixel to pixel 거리가 해상도 보다 커지므로 더 많은 정보를 얻을수 있는데도 놓치게 된다. 현미경을 설계 할때는 이 비율을 잘 설정하는 것이 중요하다.
4.2. NA(Numerical Aperture)
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파장과 입자, 이 두 성질을 한번에 가지는 빛은 회절 한계라는 것이 존재한다. 렌즈나 거울을 통해 빛을 한 점에 모아준다고 해서 무조건 작은 크기로 만들 수 있는 것이 아니라, 빛의 파장이나, 기타 조건에 의하여 특정 사이즈 이상으로 작아 질 수 없다. 이때 '기타 조건'중의 하나가 NA이고 이 값은 다음과 같다.
NA가 클수록 빛을 한점에 잘 모을수 있으며, NA를 증대 시키기 위해 구경이 크고 working distance가 작은 렌즈를 쓰거나, 샘플과 렌즈 사이에 물, oil등의 immersion material을 추가하는 방식을 사용한다.
4.3. 색수차
빛은 굴절률이 다른 두 매질 사이를 통과할때 진행방향이 꺾이는 굴절을 일으키게 된다. 그리고 이 '굴절'은 두 매질의 굴절률 차이, 진행하는 빛의 파장에 따라 그 정도가 바뀐다. (스넬의 법칙) 그리고, 매질들은 빛의 파장에 따라서도 미묘한 굴절률의 차이를 가지게 되는데, 이때문에 색수차 라는 것이 발생한다. 백색광(모든 파장의 빛이 들어있다.)을 렌즈에 입사 시켰을때 초점이 맺히는 위치가 빨간색 빛과 보라색 빛이 서로 다른것. 이 현상이 가장 잘 드러나는 것이 바로 무지개이다. 초기 현미경 제작자들은 이 현상 때문에 골머리를 썩혔다. 배율이 높다는 것은 빛을 더 많이 굴절 시킨다는 의미이고, 빛이 더 많이 굴절된다는 것은 색수차도 그만큼 더 많이 발생한다는 것을 의미하기 때문이다. 이때문에 초기 현미경 연구자들의 현미경에서는 상의 경계에 무지개 빛 선이 보이게 된다. 이는 빛의 파장에 대한 굴절률 변화가 서로 반대인 물질(파장이 낮을 수록 굴절률이 높아지는 물질과 파장이 낮을수록 굴절룰도 낮아지는 물질)을 번갈아 사용하여 렌즈를 제작 함으로써 상당부분 상쇄 가능하다. 혹은 단파장의 빛을 광원으로 사용하면 해소 가능하다. 구면수차와 더불어 광학기기를 제작 하는 업체들(현미경 렌즈 말고도 카메라 렌즈를 제작하는 대부분의 업체들)의 노하우가 집약된 부분이다. 때문에 대부분의 오래된 카메라 렌즈 제작업체들은 현미경 렌즈 제작도 겸하고 있다.
4.4. 광원
현미경은 작은 상을 확대하는 광학기기이다. 이는 상을 확대 하는 과정에서 전체적인 영상이 더 어두워짐을 의미한다. 20배로 확대를 할 경우 면적이 400배로 늘어나고, 그럴 경우 영상의 밝기는 1/400으로 줄어드는것. 이를 보완하기 위하여 대부분의 광학 현미경은 샘플에 빛을 넣어주는 광원을 추가로 설치하게 된다. 원래는 촛불이나 햇빛을 사용하던 것이 전구의 발달로 인하여 폭발적으로 발전하게 되었다. 하지만, 여전히 문제는 존재 했는데, 전구의 필라멘트가 특정 형상을 띄고 있기 때문에 현미경 사진에서 전구의 필라멘트 형태를 띈 패턴이 검출되는 것. 이를 막기 위해서 간유리(diffuser)를 추가로 설치 하거나, 광학계를 잘 설계 하여 필라맨트의 상이 영상에 맺히지 않도록 조절한 광학계를 추가로 설치하게 된다.
최근에는 레이저를 광원으로 사용하는 scanning 현미경도 등장하였다.
5. 종류
시료를 어떻게 관찰하느냐에 따라서 광학현미경과 전자현미경, 주사탐침현미경으로 구분된다.
'광학현미경(optical microscope)',은 빛을 이용하여 시료를 관찰하는 현미경이다. 빛을 관측하는 방식을 기준으로는 일반적으로 반사 또는 투과된 빛을 그대로 관측하는 광학현미경 외에도 편광필터가 추가된 편광현미경, 빛의 회절현상을 이용하여 투명한 시료의 관찰을 용이하게 한 위상차현미경, 레이저 광원을 이용하여 형광을 띄는 시료의 3차원 구조를 스캔할 수 있는 CLSM등 많은 종류가 있다. 일반적으로 가시광선 영역의 빛을 많이 이용하지만 더 좋은 분해능을 얻기 위해 X선 등 더 짧은 영역의 빛을 사용하기도 한다.
빛 외에 물질을 사용하여 관측을 하는 현미경도 있으며,전자를 이용하는 '전자현미경(electron microscope)'이 대표적이다. 주사전자현미경과 투과전자현미경으로 구분된다. 고도의 기술이 적용된(즉 아주 비싼) 투과전자현미경의 경우 아예 탄소 원자를 직접 보는 수준의 배율을 가지고 있다.
주사탐침현미경은 두 현미경과는 다르게 시료 표면을 더듬는 방법으로 시료 표면을 3차원 적으로 관찰한다. 진공이 아닌 조건에서도 전자현미경수준의 높은 배율을 가지고 있으며, 진공조건에서는 원자 수준의 관찰도 가능하다.
5.1. 광학 현미경
이 문서 제일 위 그림에 나오는 현미경이다. 보통 사람들이 현미경이라고 하면 이 현미경을 떠올리고 실제로 전공자라도 대학원생이 되기 전엔 이 현미경만 만져보는 일도 허다하다. 현미경의 시초가 바로 이 광학 현미경이고 빛만 있으면 물체를 볼 수 있어서 물체 관찰에 큰 제약이 없다. 다만 전자 현미경과는 다르게 빛으로 물체를 보는 일이기에 사용하는 빛의 파장의 길이 이하의 대상은 관찰할 수 없다. 배율은 1000배정도가 한계이나공확대or공배율, 광학현미경의 일종인 CLSM의 경우 적절한 시료 전처리와 HW/SW적 도움을 통해 5000배 이상의 배율을 가진 것들도 있다.
초등학생들도 만지는 현미경이라고 별 기능 없을 줄 아는 사람이 많지만 비싼 건 의외로 기능이 좋아서 멀티 포커스 기능으로 화면전체가 뚜렷하게 보이는 것과 같이 갖가지 신기한 기능이 있다. 종류로는 난자 등의 큰 세포나 매우 작은 생물을 볼 때 쓰는 실체현미경, 위상차를 이용해 입체적으로 볼 수 있는 위상차 현미경, 컴퓨터에 연결해서 보는 usb현미경 등 많다. [2]
유명한 제조사로는 라이카, 올림푸스, 니콘, 자이스 등이 있다.
현미경의 종류는 그 발전 방향에 따라서 여러가지로 나뉘게 된다. 일반적으로는 현미경은 더 작은걸 잘 확대만 하면 되지 않느냐. 라고 생각하기 쉽지만, 다양한 요구와 그에 따른 다양한 개발 방향이 존재 하는것. 해상도가 높은 현미경, 샘플을 절개하지 않고도 안쪽의 영상을 얻을 수 있는 현미경, 해상도는 유지 하면서 더 넓은 영역을 촬영하는 현미경, 촬영 속도가 빠른 현미경, 내가 원하는 특정 물질이나 조직만을 보는 현미경, 생물체를 살아 있는 그대로 촬영 할 수 있는 현미경 등등 수십가지 요구가 있고, 아래에 나열되는 다양한 현미경들은 그 니즈를 만족시키기 위해 과학자들이 열심히 노력한 결과이다. 모든걸 만족시키는 데우스엑스마키나는 없으니 내가 원하는 용도에 따라 적절한 현미경을 사용하는 것이 중요하다.
5.1.1. 편광현미경
5.1.2. 암시야 현미경
5.1.3. 위상차 현미경 (Phase microscopy)
5.1.3.1. 정량적 위상차 현미경 (Quantitative phase microscopy)
빛의 세기 정보를 이용하는 기존의 위상차 현미경과 달리, 시료를 거친 빛의 "phase delay"를 검출하여 영상화하는 기술로 아직 개발중이다.
크게는 두 가지 방법으로 나뉘며, 시료를 투과한 빛을 편광시켜 정보를 얻는 편광법과 시료에 빛을 반사시켜 정보를 얻는 반사법이 있다.
5.1.3.1.1. 편광 위상차 현미경(Polarization phase microscopy)
빛을 면역 형광법으로 태깅한 시료에 투과시키면 세포의 구성에 따라 빛의 굴절율이 달라지는데, 이를 편광시켜 디지털 홀로그래피를 이용해 영상화하는 기술이다.
반사법에 비해 측정이 쉽고, 전체적인 신호가 강하다는 장점이 있다.
5.1.3.1.2. 반사 위상차 현미경 (Reflection phase microscopy)
편광법에 비해 좀 더 복잡하지만, 대신 민감도가 100배 가까이 높아 살아있는 세포의 활동을 '''3차원으로 나노미터 스케일까지''' 관찰할 수 있다는 것이 장점이다.
5.1.4. 간섭 현미경
5.1.5. 형광현미경 (Fluorescence microscopy)
현재 새로이 개발되는 생체현미경의 대부분은 형광을 기반으로 개발되고 있다. 시료에 형광표지를 태깅하여 일정한 파장의 빛을 쪼이면 형광 신호가 검출되며, 이를 통해 특정 분자 혹은 생체조직, 세포의 추적이 유리하기 때문이다.
크게 비면역 형광법과 면역 형광법으로 나뉘며, 면역 형광법이 자주 쓰인다.
5.1.5.1. 공초점 현미경(Confocal microscopy)
공초점 현미경에서 '공초점'이란 pinhole을 의미한다. 일반적으로 현미경이나 카메라 같은 광학기기를 사용해 본 사람이라면 초점에서 벗어난 부분의 상은 흐릿하게 나오는 것을 알 수 있다. 이는 빛이 초점에 모이지 않아 상이 흐려지는것이다. 공초점 현미경은 초점 위치에 작은 pinhole(구멍)을 두어 초점에 모이지 않은 빛은 막고, 초점에 맞는 빛만 통과 시킨다. 이로써 깨끗하게 초점이 맞는 상 만을 획득하는 기술이 공초점 기술이다. 이 기술의 장점은 기존 광학현미경과는 다르게 깊이 구분이 가능하다는 것이다. 이때문에 샘플 안쪽에 초점이 맞춰 지더라도 초점이 맞지 않는 신호를 제거하고 초점에 맞는 신호만 받아들여 '투과'가 가능하다는점. 샘플에 따라 다르지만 생체 샘플이라면 수십~백 마이크로미터 정도의 투과도를 보인다. 이것이 공초점 현미경의 가장 큰 의의 라고 할 수 있다. 일전까지의 현미경들은 특정 세포를 관찰하기 위해서 그 세포의 위에 존재하는 다른 세포나 조직들을 모두 걷어내야 했다. 공초점 현미경은 이를 극복한 것이다.
광원으로 사용하는 빛의 '반사'를 측정하느냐, 광원에 의해 발행한 '형광'을 측정하느냐에 따라 반사 공초점 현미경과 형광 공초점 현미경으로 구분한다.
공초점 현미경은 한 점 한점의 신호를 획득하기 때문에 2차원 영상을 바로 만들어 내지는 못하기 때문에 일반적으로 XY 축 스케너나 Lens array를 이용하여 2차원 영상으로 재구성한다. 초점을 Z축 방향으로 움직이면서 XY촬영을 하면 이를 3D로 재구성 가능하다.
5.1.5.1.1. 공초점 레이저 주사현미경(CLSM)
단일파장 레이저 광원과 핀홀, CCD등의 장치의 도움을 받아 레이저 광원에 의해서 형광을 띄는 시료를 3차원 적으로 관찰 할 수 있게 해주는 현미경.
레이저 광원은 렌즈와 수직인 위치에서 시료로 조사되며, 이 레이저에 의해 시료내 형광물질이 발광하면, 이 빛을 이색성 거울이 달린 현미경을 통해서 수집한다. 이러면 평범한 현광현미경과 다를 바가 없지만, CLSM의 현미경부에는 핀홀이라는 것이 존재해서 시료의 한 점에 있는 빛만을 수집한다. 이렇게 해서는 전체 이미지를 알 수 없기 때문에 현미경의 초점은 시료를 2차원 혹은 3차원으로 스캔하고, 이를 재구성하여 이미지를 만들어낸다. 주로 세포를 연구하는 연구실에서 사용한다.
5.1.5.1.2. 반사 공초점 현미경(RCM : Reflectance confocal microscopy)
반사 공초점 현미경은 형광현미경은 아니지만, 공초점 현미경과 원리적으로 비슷하므로 이곳에 표기
5.1.5.2. 빛 시트 현미경(LSM : Light sheet microscopy)
5.1.5.2.1. 격자 시트광 현미경(Lattice light-sheet Microscope)
'''세포내에서 벌어지는 생명현상을 세포 손상 없이 보다 높은 해상도로 관찰할 수 있는 새로운 종류의 현미경.'''
기존 형광현미경에서의 레이저에 의한 시료 손상을 최소화 하기 위해서 시료를 아주 얇고 약한 레이저 시트가 훓게하고, 현미경은 레이저 시트가 지나가는 부분의 형광항체의 빛을 수집한다. 이렇게 함으로서 레이저에 의한 시료 손상이 최소화 할 뿐만 아니라 주변 빛에 의해서 상이 흔들리는것도 최소화 할 수 있다.
개발자인 에릭 베치그(Eric Betzig)는 관련 논문으로 노벨 화학상을 수상하였는데 아기 유모차를 밀다가 떠오른 논문이라고 한다. 근데 당사자는 공돌이라 화학을 전혀 모르지만 원래 물리학을 공부한것이 분자간의 거리를 어떻게 측정하느냐에 대한 아이디어에 도움이 되어 논문을 낼 수 있었고 그 아이디어를 구현한 PALM[3] 이라는 현미경까지의 업적 덕분에 수상했다. PLAM이라는 현미경도 성에 차지 않아 좌절하다가 같은 연구소 동료인 맷 구스타프손 (Mats Gustafsson)이 시작했던 SIM microscope를 만드는 프로젝트를 맷이 사망 후 인계 받아 업그레이드 시켜 격자 시트광 현미경을 완성시켰다. 원래 물리학을 공부했었던 현미경 공학 덕후의 꿈을 위한 현미경 개발에 대한 아이디어와 구현을 통한 화학적 기여로 수상한 셈이다. 이를 통해 에릭 베치그와 함께 연구했던 사람들은 세포의 복잡성과 역동성을 실시간으로 관찰할 수 있는 도구를 생물학자들에게 선사해주었다. 사이언스 논문
5.2. 전자 현미경
일단 외부 고리 주사 전자 현미경 분석과 X선 미세 분석을 읽는 것이 이해하기 쉽다는 점을 밝혀둔다.
현미경의 해상력은 빛의 파장에 의해서도 결정되는데, 광학 현미경의 가시광선 파장대로는 일정 수준 이상의 해상력을 얻을 수 없다. 그래서 빛 대신 전자를 통해 상을 얻는 현미경이 전자 현미경이다. 전자 현미경은 일상에서 볼 수 있는 양자 역학의 산물이라고 할 수 있는데, 전자 현미경이 가용한 이유 자체가 물질파 이론에 의해 전자가 파동성을 갖기 때문이다. 이 전자 간 격차는 당연히 기존 광학 현미경에 사용되는 가시광선 파장보다 매우 짧기 때문에 좋은 전자 현미경의 경우 원자까지 보는 것이 가능하다.
다만 관찰을 위해 세포를 무조건 "고정"시켜야 하는, 달리 말하자면 죽은 세포만 관찰 가능한 단점이 있다. 일반적으로는 세포를 살아있는 상태 그대로 관찰 가능한 광학 현미경[4]에 비해 큰 단점.
크게 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)과 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)으로 나뉜다. 우리가 전자 현미경이라면서 보는 표면 사진은 주사 전자 현미경(SEM)으로 보는 것이다. TEM은 X선 사진과 유사하다 생각하면 된다.
전자빔이 시료에 부딪히고(투과되고) 나오는 2차 전자, 후방 산란 전자, X선, 오제 전자, 음극선 루미네선스, 감소된 에너지 등 대부분 여러 가지 분석에 활용할 수 있다. 쉽게 말해 현미경 챔버에 온갖 잡동사니를 다 붙일 수 있다는 것.
(EDS, WDS, WPMA, EELS, AES, BEM(후방 산란 전자 검출기를 장착한 전자 현미경)
여러 종류의 하전 입자
유명한 제조사로는 FEI, 자이스, 테스칸, 지올 , 히타치 , 한국에는 코셈이 있다. 과거엔 Leica도 있었다.
Leica SEM, ZEISS SEM
여담으로 미국, 독일, 체코, 일본이 전자 현미경 제조 강국이다.
5.2.1. 주사 전자 현미경(SEM)
SEM의 경우 전자빔을 쏘아 반사된 전자를 관측하는 장비이다. 먼저, 주사전자현미경을 이해하기 위해서는 '주사'라는 것이 무엇인지 알 필요가 있다. 전자현미경은 고속으로 방출된 전자의 짧은 파장을 이용하여 보다 높은 분해능을 얻기 위한 장비이지만, 전자기 렌즈의 성능, 그리고 검출기의 집적화 문제 등으로 인하여 일반적인 광학현미경 처럼 '시료에서 반사된 빛(전자)을 렌즈로 모아 상을 맺는다'는 형태로 장비를 만들 수 없다. 때문에 전자는 전자기 렌즈를 통해 상을 맺는 것이 아니라, 전자기 렌즈와 핀홀 등를 통해서 시료의 한 점으로 집중된 전자들의 반사된 정도를 검출기로 수집하여 '시료의 어느 한 점'의 명암을 확인한다. 이 점들을 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 하여 시료 전체를 훓으면 시료 모든 표면에 대한 명암 정도를 확인할 수 있다. 이를 '주사(走査)'라고 하며, 이것을 컴퓨터 소프트웨어를 통해 화상으로 바꾸어 출력하는 것이 '주사 전자 현미경'이다.
금속과 같은 도체는 전자를 잘 반사하므로 밝게 보이지만, 부도체는 전자빔을 쏘면 전자들이 안에 들어가 안나온다. 즉 대전현상이 발생해 이미지가 왜곡된다. 그래서 일부러 금속 코팅을 따로 해주기도 한다. 하지만 생물시료나 금속코팅하면 손상을 받는 시료들은 촬영이 어렵다(Os Coating을 하면 데미지를 최대한 감소시킬 수 있다고 한다). 그래서 저진공 SEM 기법이 많은 분야에서 적용되고 있다. 경통과 챔버(전자현미경 내부 시료실) 사이의 조리개가 챔버 내부의 가스 분자들이 경통으로 유입되는 것을 방지해주는데 이때 저진공 상태에서 전자빔을 조사하면 전자빔에 의해 가스 분자가 여기(활성화 excitation)되어 다량의 이온과 전자가 발생하며, 이 전하들이 시료표면의 대전을 중화시키는 역할을 한다. 따라서 저진공에서 코팅을 하지 않고도 선명한 주사전자 현미경 영상을 얻을 수 있어 고진공환경에서와 비교해 사용자 편의성이 획기적으로 증대된다.
전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM)#도 있는데[6] 기존의 열전자총을 사용하던 주사전자현미경에선 기대할 수 없었던 고배율, 고해상도의 이미지를 얻을 수 있다.
일반적으로 고체의 표면에서 진공으로 전자를 방출시키는 원리는 크게 3가지로 분리할 수 있다.
첫번째 열에 의해 방출 되는 열전자 방출#
두번째 빛에 의해 방출되는 광전자 방출
세번째 전계 효과에 의해서 전계 방출로 구분된다.#
이 현상으로 발생하는 에너지가 열전자 방출보다 직선적이고 높은 에너지이기 때문에 시료관측할 때 좋다.
https://ko.wikipedia.org/wiki/%ED%84%B0%EB%84%90_%ED%9A%A8%EA%B3%BC
쉽게 말해서 가속전압을 가해 전자총에서 나온 전자가 경통과 전자렌즈들을 지나서 시료를 때리고 반사된 에너지를 검출기가 읽어들여서 이미지화 한다. 전자총은 날카롭고 뾰족하게 가공되며 일함수#를 줄여야 하니까 텅스텐처럼 튼튼한 금속을 써야된다.
(심지어 필라멘트가 끊어지면 갈아줘야한다. 정말 백열전구하나면 모든게 설명되는 느낌이다...)
주요 제조회사로는 JEOL (일본), Hitachi (일본), Carl zeiss (독일), FEI (미국), TESCAN (체코) 등이 주로 꼽힌다. 근래에는 대한민국에서도 하나 둘 주사전자현미경 개발에 뛰어들어 새론, 코셈, 엠크래프츠 등의 국내 업체들이 탁상형 소형 주사전자현미경 상용화를 실시하였다.
5.2.2. 투과 전자 현미경(TEM)
투과전자현미경은 1931년 독일의 Max Knoll과 Ernst Ruska에 의해 최초로 개발되었다. 최초의 투과전자현미경은 17배 정도로 확대할 수 있을 정도의 분해능을 보였으나, 현재는 개별 원자를 직접 볼 수 있는 50pm 수준에 까지 이르렀다.[7] 투과전자현미경은 전통적으로 시료에 수평한 전자빔을 조사하고 시료의 각 부분에 다다른 전자들의 산란차를 이용하여 영상에 활용하는 장치이나, 현대는 전자들을 한 점으로 집속시킨 주사형투과전자현미경을 많이 사용하는 추세이다. 일반적으로 투과전자현미경에 주사형투과전자현미경 기술을 포함하여 사용한다.
투과전자현미경은 기본적으로 광학현미경과 같은 구조를 갖는다. 광학현미경의 빛과 유리렌즈의 역할을, 전자와 구리코일을 감아서 만든 전자기렌즈로 대체하면 그 기본 구조가 같다고 볼 수 있다. 대신 빛과는 달리 전자빔이 시료에 까지 도달하기 위해서는 진공이 필요하며, 실제 진공장치성능의 비중이 크다.
전자를 사용하는 이유는 가속을 통해 빛보다 짧은 파장을 가진 전자기파를 얻을 수 있기 때문이다. 분해능은 전자기파의 파장에 비례하고 굴절율과 렌즈와 시료간 각도의 sin 함수에 반비례한다.
분해능을 향상시키는데 굴절율과 시료와 렌즈간 각도 조절은 한계가 있는데 반하여, 전자기파의 파장을 줄이는 것은 보다 용이하다.[8] 전자는 드브로이의 물질파의 특성을 가장 잘 보여주는 입자이다. 전자는 질량이 있으므로 가속을 통해 쉽게 파장을 줄일 수 있다. (p=mv=h/λ) 텡스텐과 같은 일함수가 낮은 물질에서 비교적 쉽게 전자를 뽑아낼 수 있으며, 양극판을 이용하여 전자들을 가속시킬 수가 있다. 현대 재료 연구에 가장 많이 쓰이는 200KeV의 에너지를 갖는 전자는 비상대론적 파장이 2.73pm로 가시광선 중 가장 짧은 보라색 (λ=410nm)보다 15만배정도 짧다. (2.73pm*15만=~410nm)
그러나, 실제 투과전자현미경은 광학현미경에 비해서 15만배가 아닌 약 1000배가 좋은 0.2nm 정도의 분해능을 갖는다. 그 이유는 광학렌즈에 비해서 전자기렌즈의 성능이 뒤떨어지기 때문이다.
이상적인 상황에서는 하나의 점에서 출발한 전자들은 렌즈를 지나서 다시 한 점으로 모인다. 즉 한 점에서 출발한 전자들 중 렌즈의 가장자리를 지나는 것들은 보다 많이 굴절되고, 렌즈 중심을 지나는 것들은 적게 굴절된다. 기하학적으로 한점에서 출발한 전자들은 렌즈를 지나서 다시 한 점으로 수렴한다. 그러나 현실은 전자기렌즈의 가장자리를 지나는 전자는 렌즈에 보다 가까운 쪽에 렌즈 중심 근처를 지나는 전자들은 보다 멀리 수렴하게 되며, 실제 한 점은 렌즈 탓에 원반이 된다. 이를 구면수차라고 부른다.
구면수차 보정 방법은 수학적으로는 이미 해결된 것이었으며, 허블 망원경처럼 광학계에서 먼저 사용되어 왔다. 수차보정기를 장착한 투과전자현미경을 수차보정투과전자현미경으로 부른다. 주사형투과전자현미경의 분해능을 높이기 위해서는 집속렌즈의 성능을 높일 필요가 있으므로 집속렌즈 쪽에, 수평한 전자빔을 이용하는 투과전자현미경 영상을 구현을 위해서는 시료에 의해 산란된 전자들을 모으는 대물렌즈의 성능을 높이기 위해 대물렌즈 쪽에 수차보정기를 부착한다.
수차보정기의 등장은 특히 ~0.2nm의 수준의 주사형투과전자현미경 분해능을 0.1nm로, 약 절반정도 향상시켰다. (현재는 0.065nm 정도) 그러나 이러한 차이는 원자를 명확히 볼 수 있느냐 없느냐의 문제로 분해능 향상의 차원의 효과 정도가 아니다. 일반적으로 알려진 투과전자현미경 고분해능 영상(High Resolution Electron Microscopy image)은 실제 원자의 영상들이 아니다. 이들은 원자들의 규칙적인 배열 때문에 전자빔이 분화되고, 시료를 빠져 나오면서 서로 간섭하여 만들어진 간접상이다. 실제 원자의 영상은 주사형투과전자현미경에 의해 가능하며, 수차보정기에 의해 2배 정도로 향상된 분해능은 원자를 관찰할 수 있는 현미경과 아닌 현미경을 가르는 중요한 의미를 가진 수치이다.
빛과는 달리 전자는 시료를 투과할 수 있는 능력이 적어, 투과전자현미경 관찰을 위해서는 시료를 얇게 썰어내야 한다. 일반적으로 원자영상관찰을 위해서는 20nm 정도의 두께가 필요하다.
주요 제조 회사로는 JEOL (일본), Hitachi (일본), FEI (Thermo Fisher Scientific 산하 / 미국) 등이 있다. 최근 사용하는 TEM은 수십억대를 호가하는 상당히 고가의 장비이다.
5.2.3. 광전자 융합 현미경
한국표준과학연구원 관련 뉴스
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5.3. 주사 탐침 현미경(Scanning Probe Microscope, SPM)
전자 현미경과는 다르게 매우 작은 탐침(Probe)를 이용하여 시료의 표면을 관측하는 장비로, 현미경의 분류 안에서는 그 역사가 가장 짧다. 탐침을 주사한다는 의미에서는 같으나 관측하는 방식에 따라 크게 주사 터널링 현미경(Scanning Tunneling Microscope, STM)과 원자간 힘 현미경(Atomic Force Microscope, AFM. 줄여서 원자현미경이라고 칭하는 경우도 종종 있다)으로 나뉜다.
5.3.1. 주사 터널링 현미경(STM)
탐침을 표면 위로 움직여 전자의 터널링에 의한 터널링 전류를 측정한다. 탐침과 표면 사이 거리가 가까울수록 전류가 커지는 것을 통해 표면의 모양을 그릴 수 있다. 단일 원자 수준의 크기를 관찰 가능하지만, 도체만 측정 가능하고 고진공 상태가 필요하다는 것이 단점.
STM은 기본적으로 전자의 분포를 보는 것이기 때문에, 전자가 비편재화된 경우 원자가 뚜렷하게 보이는 대신 전자 분포가 보인다. 대표적인 경우가 그래핀.
여담으로, 주사 터널링 현미경을 주제로 한 기술 지문이 2019학년도 대학수학능력시험 9월 모의평가 국어영역에서 독서 지문으로 출제되었다.
5.3.2. 원자간 힘 현미경(AFM)
주사 터널링 현미경이 도체에만 적용가능한 단점을 보완하기 위해 만들어진 장비로, 부도체에도 사용할 수 있으며 공기중 저온상온고온에서 심지어는 용액속에서도 측정이 가능하다. 현미경의 캔틸레버에 달린 매우 작은 팁이 표면을 긁으며 측정하는 Contact mode, 현미경 팁이 표면을 두드리며 측정하는 Tapping mode,[9] 팁과 원자간의 반 데르 발스 힘을 이용하여 측정하는 Non-contact mode가 있다. 일반적으로는 Tapping mode가 가장 많이 이용되지만 목적에 따라 모드를 달리할 수 있다. 현대에 들어 전자현미경과 함께 가장 많이 이용되고 최근 향상된 성능으로 인해 펜타센 분자(폴리아센참고)를 마치 장난감 모형처럼 찍어낼 정도로 분해능이 좋아졌다. 같은 펜타센을 STM으로 측정하면 펜타센의 전자분포만 보여줄뿐 분자의 형태는 알 수가 없었다. 물론 분자정도의 해상도를 찍으려면 특수한 AFM이 필요하다. 보통의 AFM은 0.5~1 nm(x,y,z축마다 조금씩 다르지만)의 분해능을 가지고 있다.
주요 제조 회사로는 Bruker (미국), Agilent (미국), Park systems (한국, 의외로 AFM 강국이다) 등이 있다. 주요 악세사리에 따라서 가격이 천차만별이다. 어떠한 환경에서 어떤 샘플을 찍느냐에 따라 완전히 달라진다. 일반적인 AFM은 테이블 위에 올려놓을 정도의 크기지만 고진공 시스템을 사용하는 경우 전체 장비가 방 한칸을 모두 차지하며 비싸다.
[1] 그리스도교 주류의 보수적인 당시 사회 특성상 수음이 아니라 아내와의 자연스러운 관계에서 채집된 물건이란 사실을 실제로 무척 강조했다.[2] 근데 이걸 다루는건 정말 철저한 문과두뇌가 아닌이상 수업만 잘 듣고 3번만 해보면 능숙해진다. 가끔씩 프레파라트가 막장인데 자기가 현미경 다루는 솜씨가 부족해서 초점이 안맞는줄 아는 경우가 있는데, 현미경 다루는 것 자체는 정말정말 쉬우니 초점이 안잡힐경우 프레파라트를 먼저 의심해보자.[3] Photo-activated localization microscopy, 플래시를 연속적으로 터트리듯이 시료에 광자를 조금씩 뿌리고, 이로 인해서 형광항체에서 나온 광자를 CCD로 수집, 누적된 데이터를 바탕으로 하여 기존 현미경의 회절한계를 넘어서는 분해능을 구현한 형광 현미경[4] 광학 현미경이라도 종류에 따라 세포를 고정시켜야 할 수 있다.[5] 
[6] 링크의 이론과 개념을 모르면 전자현미경의 원리를 알 수가 없다. [7] 미국의 TEAM project, 2009년[8] 시료과 렌즈간 각도는, 쉽게 말하자면 더 잘 보기 위해서는 더 가까이 다가가야 하는데, 이 경우 눈과 보는 지점간의 각도는 더 커지게 된다.[9] 점자 기본 원리와 동일하다
[6] 링크의 이론과 개념을 모르면 전자현미경의 원리를 알 수가 없다. [7] 미국의 TEAM project, 2009년[8] 시료과 렌즈간 각도는, 쉽게 말하자면 더 잘 보기 위해서는 더 가까이 다가가야 하는데, 이 경우 눈과 보는 지점간의 각도는 더 커지게 된다.[9] 점자 기본 원리와 동일하다